انواع روشهای خالص سازی ماکرومولکولها (پروتئین ها، آنزیم ها، پپتیدها)

1- کروماتوگرافی طرد اندازه SEC یا ژل فیلتراسیون: در این روش نمونه های پروتئینی براساس اندازه شان از یکدیگر جدا می شوند که روشی غیر اتصالی هست و از روش برای خالص سازی نمونه پروتئینی، جداسازی نمک از پروتئین و تغییر بافر نمونه ها استفاده می شود. ساپورت (بستر فاز ثابت) در این روش دانه های خلل و فرج داری است که بافر و پروتئین با اندازه کوچک می توانند از درون آنها عبور کنند. این ساپورتها انواع مختلفی دارند مثل سفاروزهاsepharose ) و sepharose 4B و sepharose 6B و Sepharose CL-4B و Sepharose CL-6B ) و سفادکسها ( Sephadex G-25 و Sephadex G-50 و Sephadex G-100 و Sephadex G-200) و سفاکریل ها ( Sephacryl S-200 و Sephacryl S-300 و Sephacryl S-400 ) می باشد.

2- کروماتوگرافی تعویض یونی IEC : در این روش پروتئین ها بر اساس تفاوت بارسطحی شان از هم جدا می شوند. خالص سازی بر اساس یک میانکنش برگشت پذیر بین یک پروتئین باردار و یک بستر یا لیگاند با بار مخالف ( برهمکنش های یونی) است. در روش ژل فیلتراسیون پروتئین های که خالص سازی شده اند رقیق می شوند ولی در این متد رقیق نمی شوند. ساپورت (بستر فاز ثابت) در این روش دارای گروه های اسیدی و قلیایی متعددی می باشد که این تعویض کننده های یونی قلیایی شامل گروه های با بار مثبت اند که تعویض کننده آنیونی نامیده می شوند. تعویض کننده های کاتیونی حامل گروه های با بار منفی اند که گروه های با بار مثبت را جذب می کنند. انواع این ساپورت ها عبارتند از DEAE-sepharose و QA-sepharose و CM-sepharose و SP-sepharose
3- کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز HIC : در این روش پروتئین ها بر اساس تفاوت در میزان هیدروفوبیسیته سطح شان از یکدیگر جدا می شوند. بدین صورت که میانکنش برگشت پذیر بین نواحی غیر قطبی در سطح پروتئین و لیگاندهای هیدروفوب تثبیت شده بر روی ساپورت ستون کروماتوگرافی شکل می گیرد. پروتئین ها بر اساس تفاوت در میزان اسیدآمینه های هیدروفوب سطحی شان از یکدیگر تفکیک می شوند. این روش می تواند در فرآیند های تخلیص چند مرحله ای به عنوان یکی از روش های میانی بکار گرفته شود. نمونه ای از این ساپورت ها عبارتند از Butyl-sepharose و Phenyl-sepharose و Octyl-sepharose
4- کروماتوگرافی تمایلی : در این روش تخلیص پروتئین هدف با یک لیگاند ویژه متصل شده به ساپورت کروماتوگرافی میانکنش برگشت پذیر برقرار می کند. لیگاند مورد استفاده می تواند آنتی بادی، اسید نوکلئیک، انواع قند ها مثل گلوکز، انواع رنگ دانه های آلی، انواع ترکیبات داروئی، انواع ماکرومولکول ها و انواع فلزات تثبیت شده بر روی ساپورت باشند. برهمکنش لیگاندهای تثبیت شده بر روی ساپورت با پروتئین ها به طریق مختلف انجام می شود. این برهمکنش ها می توانند از نوع یونی، آبگریز یا هیدروژنی باشند. این روش قدرت تفکیک و ویژگی بالایی دارد. از فلز تثبیت شده بر روی ساپورت برای خالص سازی پروتئین های نوترکیب حاوی دنباله پلی هیستیدین استفاده می شود. انواع این ساپورت ها عبارتند از Ni-sepharose و NTA-sepharose و Co-sepharose و Fe-sepharose و Glutathione-sepharose و p-Aminobenzamidine-sepharose. ساپورت هایی که حاوی گلوتاتیون با اتصال کووالانسی برای تخلیص پروتئین های ادغامی GST به کار گرفته می شوند. از آنجاییکه بخش GST از پروتئین ادغامی با تمایل بالا ( برخلاف پروتئن های میزبان) به گلوتاتیون می چسبد، این تکنیک زمینه را برای راندمان های بالای تخلیص فراهم می سازد.