روش‌های سنجش اندوتوکسین

روش‌های سنجش اندوتوکسین

لیپوپلی‌ساکارید (LPS)، معروف به اندوتوکسین، جزء اصلی غشای خارجی باکتری‌های گرم-منفی است که می‌تواند پاسخ‌های التهابی شدید و شوک سپتیک ایجاد کند. سنجش دقیق و حساس آن در صنایع داروسازی (کنترل کیفیت محصولات تزریقی)، تحقیقات پایه و تشخیص بالینی از اهمیت حیاتی برخوردار است. این مقاله به بررسی سیر تکاملی روش‌های سنجش LPS می‌پردازد.

اهمیت سنجش LPS

لیپوپلی‌ساکارید (LPS) اندوتوکسین اصلی باکتری‌های گرم-منفی است که حتی در غیاب باکتری زنده می‌تواند از دیواره سلولی آزاد شود و از طریق اتصال به گیرنده TLR4 در سلول‌های ایمنی میزبان، یک واکنش التهابی آبشاری بالقوه کشنده (مانند سندرم پاسخ التهابی سیستمیک و شوک سپتیک) را راه‌اندازی کند[1] . به دلیل همین قدرت بیماری‌زایی، حذف و سنجش LPS از داروهای تزریقی، واکسن‌ها، دستگاه‌های پزشکی و فرآورده‌های بیولوژیک یک الزام قانونی و بخشی حیاتی از کنترل کیفیت در صنایع داروسازی و بیوتکنولوژی است.

روش‌های اولیه مبتنی بر حیوان آزمایشگاهی: آزمون تب خرگوشی (RPT)

پیش از توسعه روش‌های آزمایشگاهی (in vitro)، آزمون تب خرگوشی (Rabbit Pyrogen Test یا RPT) به عنوان استاندارد اصلی تشخیص پیروژن‌ها (مواد تب‌زا) از جمله LPS مورد استفاده قرار می‌گرفت. در این روش، نمونه مورد آزمایش به صورت داخل وریدی به سه خرگوش سالم تزریق می‌شود و افزایش دمای بدن آن‌ها در مدت زمان مشخصی اندازه‌گیری می‌گردد . یک آزمون «کل‌نگر» محسوب می‌شد. با این حال، این روش معایب عمده‌ای داشت که محدودیت‌های اساسی آن محسوب می‌شدند: نیاز به تعداد زیاد حیوان، هزینه ی بالا، زمان‌بر بودن فرآیند، تغییرپذیری ذاتی پاسخ بین گونه‌ای و درون گونه‌ای، و مهم‌تر از همه، نگرانی‌های اخلاقی . این محدودیت‌ها محرک قوی برای جستجوی جایگزین‌ برای روش درون‌شیشه‌ای شد.[2]

SDS-PAGE و رنگ‌آمیزی کوماسی برای LPS

الکتروفورز ژل پلی‌آکریل آمید در حضور دودسیل سولفات سدیم (SDS-PAGE) به دنبال رنگ‌آمیزی با کوماسی بلو R-250، به عنوان یک متد کنترل کیفی ضروری در مطالعات لیپوپلی‌ساکارید (LPS) به کار می‌رود. در این روش، ابتدا نمونه LPS استخراج‌شده (به عنوان مثال با روش فِنُل-آب) در بافر نمونه حاوی SDS و مرکاپتواتانول حرارت داده می‌شود تا دناتوره شود. سپس در یک سیستم ژل دوگانه (ژل متراکم‌کننده و جداکننده) تحت میدان الکتریکی قرار می‌گیرد.

در ژل الکتروفورز باند های LPS در 3 قسمت دیده میشود قسمت Lipid A که در 3 تا 10 کیلو دالتون باند نشان میدهد قسمت Core oligosaccharide   باند میانی در 10 تا 20 کیلو دالتون و قسمت O-antigen با پلی ساکارید بلند باند بالا را ایجاد میکند که 20 تا 100 کیلو دالتون است .

اندازه گیری و سنجش: LPS

اسپکتروفتومتری به عنوان یک روش سریع، کم‌هزینه و پرکاربرد برای سنجش کمی غلظت لیپوپلی‌ساکارید (LPS) در محلول‌های نسبتاً خالص، اغلب بر اساس اندازه‌گیری جذب نوری در طول موج‌های مشخص به کار می‌رود. این روش عمدتاً بر ویژگی‌های فیزیکی-شیمیایی خود LPS، به ویژه جذب در ناحیه ماوراء بنفش (UV) متکی است. بخش لیپید A در مولکول LPS حاوی گروه‌های کربونیل و دیگر کروموفورهاست که جذب قابل توجهی در محدوده ۲۰۵ تا ۲۳۰ نانومتر ایجاد می‌کند.

انقلاب در سنجش: آزمون لیزات آمبوسیت لیمولوس (LAL)

کشف این که همولنف خرچنگ نعل‌اسب (Limulus polyphemus) در حضور LPS منعقد می‌شود، منجر به توسعه انقلابی آزمون لیزات آمبوسیت لیمولوس (Limulus Amebocyte Lysate یا LAL) در دهه ۱۹۷۰ شد. این آزمون، یک سیستم بیولوژیکی بسیار حساس درون‌شیشه‌ای را فراهم کرد . مکانیسم آن بر اساس یک آبشار آنزیمی است: LPS، فاکتور C (یک پروآنزیم) را در لیزات فعال می‌کند. این فاکتور فعال شده به نوبه‌خود یک سری از پروتئازها را فعال می‌کند که در نهایت منجر به لخته شدن پروتئین انعقادی (coagulogen) به فیبرین‌مانند (coagulin) می‌گردد . حساسیت فوق‌العاده این سیستم (تا ۰٫۰۰۱ EU/mL) آن را به استاندارد طلایی صنعت برای سنجش اندوتوکسین تبدیل کرده است. امروزه LAL تحت نظارت فارماکوپه‌های معتبری مانند USP (ایالات متحده) و EP (اروپا) قرار دارد و برای آزادسازی اکثر محصولات دارویی تزریقی الزامی است.[3]

نتیجه‌گیری و چشم‌انداز آینده

سنجش LPS از یک آزمون مبتنی بر حیوان کامل (RPT) به سمت یک فناوری آزمایشگاهی بسیار حساس (LAL) و اکنون به سمت پلتفرم‌های نوین مبتنی بر سلول‌های انسانی (MAT) و بیوسنسورها تکامل یافته است. انتخاب روش بهینه به نیازهای خاص بستگی دارد: روش‌های LAL برای کنترل کیفیت روتین محصولات دارویی همچنان کارآمد و ضروری هستند، در حالی که MAT برای غربالگری پیروژن‌های غیر-LPS و در مواردی که نگرانی‌های اخلاقی مطرح است، گزینه برتر محسوب می‌شود. بیوسنسورها نیز پتانسیل تغییر پارادایم در تشخیص سریع بالینی را دارند. چالش‌های آینده شامل استانداردسازی روش‌های جدید، مدیریت تداخلات در ماتریکس‌های پیچیده و کاهش بیشتر هزینه‌هاست. روند کلی به سمت توسعه روش‌هایی است که سریع‌تر، اختصاصی‌تر، اخلاقی‌تر و قابل‌دسترس‌تر باشند تا ایمنی بیماران و پیشرفت تحقیقات را بیش از پیش تضمین کنند.[4]

منابع

1. Zhao, Y.T., et al., Reciprocal relationship between plasma ghrelin level and arterial stiffness in hypertensive subjects. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2013. 40(11): p. 735-9.
2. Burgmaier, L., et al., Validation of the Monocyte Activation Test Demonstrating Equivalence to the Rabbit Pyrogen Test. Int J Mol Sci, 2025. 26(22).
3. Kawabata, S. and S. Iwanaga, Role of lectins in the innate immunity of horseshoe crab. Dev Comp Immunol, 1999. 23(4-5): p. 391-400.

4.  Joerger, R.D., I.B. Hanning, and S.C. Ricke, P