جذب LPS توسط رزین کروماتوگرافی

جذب LPS توسط رزین کروماتوگرافی

اندوتوکسین ها (LPS) از اجزای دیواره سلولی باکتری های گرم منفی هستند و حضور آن ها در محصولات دارویی می تواند باعث واکنش شدید التهابی ، تب ، شک سپتیک و واکنش سیستم ایمنی گردد . یکی از کارآمد ترین راهکار ها حذف آندوتوکسین با استفاده از رزین کروماتوگرافی است.

مقدمه

وجود اندوتوکسین در محصولات دارویی به‌ویژه واکسن‌ها، داروهای پروتئینی و فرآورده‌های خونی، چالشی مهم و اساسی در صنعت داروسازی محسوب می‌شود. روش‌های مختلفی برای حذف اندوتوکسین پیشنهاد شده‌اند؛ شامل استخراج دو فازی، فیلتراسیون غشایی، کروماتوگرافی تبادل یونی، کروماتوگرافی آب‌گریز، جذب اختصاصی و اولترافیلتراسیون.

ساختار لیپوپلی ساکارید باکتری

خصوصیات بیوشیمیایی LPS که باعث سخت شدن حذف آن میگردد :

LPS دارای سه بخش میباشد :

• وجود لیپید A در LPS که حاوی اسید های چرب C12-C14 ، دارای بار منفی (دوفسفاته ) میباشد و هیدروفوب است .
• وجود core در LPS که کمربند میانی است . حاوی KDO (2-keto-3-deoxy-octulosonic acid)، heptose ، فسفات میباشد و بار منفی بسیار بالا دارد .
• دارای O-antiden میباشد که باعث افزایش سایز و به هم چسبیدن میشود

تعامل LPS با پروتئین ها و اثر آن در کروماتوگرافی:

LPS با پروتئین ها از 3 طریق کمپلکس (Complex) ایجاد میکند :

1. Electrostatic bridges: باعث ایجاد پل یونی میشود . فسفات های LPS با گروه های کربوکسیلات پروتئین پل یونی ایجاد میکند و +Ca2این پل را قوی تر میکند .
2. Hydrophobic insertion: لیپید A وارد حفره های non-polar پروتئین میشود .
3. Micelle entrapment: پروتئین داخل aggregate LPS گیر می افتد .

تحلیل روش های کروماتوگرافی

1. Chromatography

بر پایه تعامل اختصاصی لیگاند و LPS عمل میکند .  در این روش، رزین کروماتوگرافی دارای یک لیگاند است که به‌طور مستقیم با ساختار اندوتوکسین پیوند برقرار می‌کند. مهم‌ترین لیگاندهای مورد استفاده شامل پلیمیکسین B، هیستیدین، آرژنین، پلی‌لیزین میباشد .

تعامل الکتروستاتیک  بین گروه مثبت لیگاند و منفی فسفات های LPS اتفاق می افتد و تعامل هیدروفوبیک با بخش چرب لیپید A اتفاق می افتد .

2. Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)

جذب LPS با استفاده از تعامل هیدروفوبی انجام می‌شود. بخش Lipid A دارای زنجیره چرب قوی است و در حضور نمک‌های بالا مثل آمونیوم سولفات ، سدیم سیترات LPS تمایل دارد به لیگاند های هیدروفوب متصل شود .

این روش زمانی موفق است که هدف، حذف LPS از محلول‌هایی باشد که پروتئین‌های حساس در آن نیستند، زیرا حضور نمک بالا می‌تواند باعث دناتوراسیون پروتئین شود.

3. Anion Exchange Chromatography (AEC)

کروماتوگرافی تبادل آنیونی یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای حذف اندوتوکسین از محلول‌های پروتئینی و DNA است. اندوتوکسین‌ها در pH فیزیولوژیک دارای بار منفی قوی هستند، به همین دلیل رزین‌هایی که دارای گروه‌های مثبت‌اند مانند( DEAE، Q-Sepharose و Fractogel-DEAE )  می‌توانند LPS را جذب کنند.

و یکی از نگرانی های این روش این است که اگر پروتئین بار مثبت داشته باشد، LPS تمایل دارد همراه آن پروتئین از ستون عبور کند و بنابراین حذف کامل رخ نمی‌دهد. این روش وابسته به قدرت یونی بافر است کاهش غلظت نمک باعث افزایش اتصال LPS میشود .

منابع:

[1] P. Magalh˜aes, A. M. Lopes, P. G. Mazzola, C. Rangel-Yagui, T.C. V. Penna, and A. Pessoa, “Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review,” Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol. 10, no. 3, pp. 388–404, 2007.

[2] P. M. Montbriand and R. W. Malone, “Improved method for the removal of endotoxin from DNA,” Journal of Biotechnology,vol. 44, no. 1–3, pp. 43–46, 1996.

[3] Liu, P., Lin, H., & Wang, J. (2025). Preparation of Polymyxin B-Functionalized Cryogels for Efficient Endotoxin Removal from Protein Solutions. Gels, 11(6), 402. https://doi.org/10.3390/gels11060402